以电子线路概念改造有害细菌的DNA:医疗变形细菌


翻译:林雅玲

再过几个月,一小群罹患严重疾病的受试者将服用数十亿个能吞食毒素的生物机器,以测试新型的疾病疗法。新生物机器并非由金属、电线或塑胶零件製成的机器,而是以生医工程技术改造、能执行複杂医疗程序的生物──细菌。

美国麻州的生物科技新创公司Synlogic的研究人员,将让受试病人每日服用内含数十亿个大肠桿菌(Escherichia coli)的胶囊或药水。这种微生物在我们肠道相当活跃,偶尔会引起感染,但通常与我们和平共处。全新打造的大肠桿菌不同之处,在于科学家修改了大肠桿菌的DNA,让这些微小细菌变成一种生物机器,能持续吞食患者身体里累积的有毒分子:氨。

罹患尿素循环代谢异常(urea cycle disorder, UCD)的病患,遗传了带有缺陷的基因,身体製造出的酵素有缺陷,无法分解高蛋白食物(例如肉类、鸡蛋和乳酪)中的氮。正常肝脏酵素会把过量的氮转化为尿素,随着尿液排出体外;然而UCD患者的肝脏酵素无法分解体内的氮,堆在体内的氮产生有毒的氨在血液中循环,对大脑造成严重破坏。

原本肠道细菌就会摄取少量氨,运用其中的氮做为生长所需的养份。科学家透过新式基因工程技术让微生物带有新的「基因线路」(genetic circuit)︰把一系列的基因和调节基因的DNA片段连结在一起,宛如电子产品中的电晶体,能够调控并开关基因。科学家把这种基因线路嵌入大肠桿菌的基因组,取代原本缓慢消耗氨的机制;带有强化基因组的大肠桿菌一旦侦测到低氧环境(例如人类肠道),便会启动大量消耗氨的模式。

Synlogic的基因修饰细菌在小鼠实验中测试成功,如果它们也能吞噬人体里的氨,那幺UCD患者每日服用这种细菌配方,也许就能终生不再发病。强化版基因修饰细菌有机会治癒这种严重的遗传疾病,每年美国有100多名新的UCD患者确诊,目前还没有适当的医疗方法。Synlogic首席科学主管米勒(Paul Miller)说:「我们以全新微生物疗法弥补患者缺失的生理功能,这种疗法相当惊人且成效优良。」Synlogic公司正针对更常见的疾病包括躁性大肠症候群(IBD)、发炎、免疫疾病甚至癌症,设计类似的微生物基因线路。

基因经过改造的细菌比传统药物更有关键优势,因为一般药物是由化学物质组成,医生唯一能调整的是剂量;而在微生物疗法中,医师能微调细菌的基因线路以增强治疗效力,或调控细菌活化的时间,而且它们也具有关闭的功能,所以更加安全。细菌能感知和反应所处环境,因此可以设计基因经过改造的细菌,使其到达病灶部位再释出治疗药物,这种选择性标的功能可避开传统药物作用于全身所带来的副作用。

基因修饰的细菌在人体内也有自我繁殖的能力,传统药物无法做到这点。当然这些微生物必须通过安全测试,研究人员也认同必须证明这些带有强化基因的微生物不会排出人体而危害环境。美国食品及药物管理局(FDA)已核准Synlogic公司于今年进行人体试验,因为他们在UCD疗法中使用的大肠桿菌菌株,之前已认定安全并且用来当做治疗IBD的口服益生菌。如果完成人体试验,该公司的微生物基因疗法将成为基因工程学的新分支「合成生物学」在临床应用上的首例。

合成生物学的兴起

合成生物学的发展有赖科学家操控DNA的技术进展过程,这些新的实验技术让科学家把多种DNA片段连接起来,製造出比单纯改变一个基因更强大的效果。美国麻省理工学院(MIT)医学工程学教授、合成生物学领域的先驱柯林斯(James Collins)表示:「合成生物学已经展现出一些令人刮目相看的成果。」例如比起传统糖尿病疗法,患者每天得注射胰岛素,微生物疗法因带有强化的DNA线路,能更精準地把胰岛素送入糖尿病患者的血液。科学家也重新改造会导致食物中毒的沙门氏菌(Salmonella)DNA,让它们在靠近癌细胞时释出抗癌药物。

装配DNA线路的微生物也可用来诊断疾病:最近波士顿的研究人员改造一种微生物,能在住院病患血液出现早期败血症感染时即时示警,现有的检验方法难以侦测这个问题,常会拖到患者情况更严重、更难治疗时才发觉。

合成生物学的这门新技术具有革命性潜力,不仅针对细菌等微生物,对人体医疗也是。加州大学旧金山分校系统与合成生物学中心的主任林行健(Wendell Lim)说:「生物医学是医疗新革命的起点,微生物和人类细胞逐渐转变为多功能的治疗引擎。」然而现实情况并非总是那幺美好。

过去40年科学家运用遗传工程来了解并操纵基因,揭开控制生命的複杂机制,但是科学家并不清楚现实情况中不同基因如何结合在一起共同运作。在实验室试管中看起来不错的成品,在真实的细胞或动物体内却分解了,柯林斯也承认合成生物学刚起步时,有很多实验设计属于不实宣传的炒作。但他和志同道合的生物学家从17年前开始,受惠于DNA定序和合成技术的进展,一直使用新发现的基因和其他DNA部件做为可互换的组件,设计并开发出可在生物体内运作的应用疗法。

以电子线路概念改造有害细菌的DNA:医疗变形细菌

改变的动力有一部份来自科学家,因为这些研究人员大多是工程师出身,领导加州大学圣地牙哥分校生物线路研究所的科学家哈斯提(Jeff Hasty)说:「过去几年我们的一些新想法趋于一致,推动了这领域的发展。」哈斯提拥有物理学博士学位,20年前展开他的合成生物学研究生涯,他开玩笑描述现在的他,就像是「计算生物学和分子生物学的混血儿」。合成生物学领域聚集很多类似哈斯提这样的科学家,他们拥戴工程师实做的精神。柯林斯说:「就像很多电机工程师使用导体、电阻器和电容器来打造新的电子设备,我们把生物的基因、蛋白质、RNA、转录因子和其他DNA部件组合在一起,打造特定功能。」

柯林斯提到,若想要了解微生物基因线路的核心概念,可利用电子产品来类比:想像一台空调恆温器,它能侦测热空气的输入(input),也能开启空调系统做为输出(output),当环境的气温下降,恆温器就会关闭空调系统。单细胞微生物(例如细菌)就是以类似的方式存活,当出现输入讯号(竞争微生物)时,细菌则做出「输出」反应,分泌天然抗生素以杀死敌人。

打造基因线路

合成生物学家建构基因线路的方法,源于柯林斯和另一个研究团队多年前碰巧提出的相似创见。2000年1月,任职于波士顿大学的柯林斯领导的实验室,在《自然》上发表一种「基因开关」,同份刊物也报导普林斯顿大学研究团队的合成基因线络。

这两份论文被视为合成生物学的滥觞,柯林斯提到这两篇文章不约而同指出:「我们能取出细胞的一部份并连结起来,就像工程师那样创造新的电路。」当时柯林斯确实被线路围绕,因为他正领导为残障者设计机械义肢的生物工程实验室。

目前柯林斯在麻州剑桥地区三个不同的合成生物学研究机构工作,他已培育了将近20名合成生物学家,其中哈斯提已拥有自己的研究团队。

DNA开关问世后的几年里,当时仍然很小众的合成生物学社群进入白热化的竞争阶段,竞相利用细胞本身与生俱来的侦测和反应行为建构出越来越複杂的线路。林行健说:「我们经历这一切,才了解细胞比我们原先想像的更加多才多艺。」他把细胞描述为可调整的「汽车底盘」,研究人员可放进不同的基因发动机来执行医疗功能。2006年,加州大学柏克莱分校化学家克斯林(Jay Keasling)的研究团队首度推出商业应用。当时克斯林领导的实验室接受比尔盖兹夫妇基金会资助的4,260万美元,利用人工设计的基因线路改造烘焙用酵母菌的代谢途径,使它们能转化糖分子为疟疾药物青蒿素的关键成份。

过去製造青蒿素的前驱分子得从亚洲青蒿以人工萃取出来,这种昂贵的程序使得药物成本太高而无法用于疟疾猖獗的贫穷地区。柯林斯说:「这是巨大突破,科学家首度运用完整的基因网络,改变过去一个一个基因慢慢来的方式,把酵母菌转化为解决现实世界重大流行疾病的解药。」

美梦变噩梦

然而,这个创举并没有引发革命。当时着名的基因组科学家凡特(J. Craig Venter)加入了合成生物学的竞技场(他也是合成基因组公司的创办人之一),成为该技术的第一位明星。他在2009年获得艾克森美孚石油公司高达三亿美元的资助,用来完成他鼓吹的研究目标:利用池塘绿藻製造汽油。2010年,克斯林获得美国能源部(DOE)1亿3400万美元的资助,计画让酵母菌从含糖植物的化学物质合成柴油。2000年代初期,克斯林也共同创办了艾美利斯生技公司,这家公司的目标是推出替代燃料的商业技术。

最终,这两项计画都留给合成生物学莫须有的污名,四年后,艾克森美孚和凡特(以及艾美利斯生技公司)基本上都放弃了合成石油计画。与目前低价的石油和天然气相比,扩大微生物生产石油所需的商业成本迫使艾美利斯和其他一些新创公司暂停相关计画,这些公司成为投资者的噩梦。

艾美利斯和几家在2005~2010年创办的合成生物技术公司起初承诺要推出微生物製石油,也持续在生物线路设计方面取得显着进展,但新的基因线路并未广泛受到青睐。相反地,这些只红过一次的合成生物学摇滚明星重新打造微生物,成为用来製造溶剂、润滑剂和其他产品的主要成份,包括化妆品、香料、洗涤剂和成药。

当华尔街的投资者和科技媒体大多关注微生物製造燃料的梦想,以及梦想破灭后的现实,柯林斯和同事在21世纪的第一个10年,默默为了即将来临的「更优良疗法」着手解决技术障碍。经过多年繁琐的试验,柯林斯在2010年改造出一种细菌,在实验室测试时能让抗药性细菌变虚弱,使抗生素仍可发挥药效。

大约在同一时间,柯林斯培育的另一名博士后研究员卢冠达(他拥有MIT电机和资讯工程博士学位以及哈佛大学医学学位),把基因线路嵌进一种不同类型的微生物──能感染细菌的病毒(也称为噬菌体)。有些难以治疗的细菌感染是因为细菌形成的菌落外覆有黏滞的保护性生物薄膜(biofilm),细菌可能是为了防止病毒的侵犯而演化出生物薄膜。

以电子线路概念改造有害细菌的DNA:医疗变形细菌 公有领域, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2740748
金黄色葡萄球菌生物薄膜(Biofilm),在留置导尿管中。

卢冠达安装在病毒的线路装配了一种基因,这个基因能製造出分解生物薄膜的酵素。卢冠达的基因线路还能让病毒侦测到生物薄膜,随后突破防御并释出破坏生物薄膜的酵素。

卢冠达和柯林斯明白他们研发的病毒可能需要好几年的改进才能臻于完美,但他们也认为自己研发的另一种细菌也许很快就有商业用途。在2013年的一次聚会中,柯林斯和卢冠达告诉Atlas Venture生技创投公司,他们实验室开发出基因强化的微生物,能做为活性侦测器,用于早期检测人体疾病,或是检验空气或水中的污染物质。

精巧设计新增用途

不过,Atlas Venture高层对另一个概念比较有兴趣:如果改造的细菌不仅可充当巡逻员,还能在侦测到人类肠道内的问题后进行治疗,这商业利润当然更为可观。于是,以实现这个理想为目标的Synlogic公司诞生了;2015年初,大约在聘请第一批研究人员的六个月后,Synlogic就根据柯林斯和卢冠达的发明开发出UCD疗法的初始版本。Synlogic的顾问乔里拉(Bharatt Chowrira)说:「我在製药行业很久了,但从没见过开发某种药物从科学家的最初想法到完成临床试验,只花费这幺短的时间。」

改造细菌基因线路做为医疗策略的概念相当高明,是几十年来生物学家研究大肠桿菌的成果应用。细菌的生长机制是从氨获取氮源,Synlogic透过基因线路改造细菌成为生产精胺酸(arginine,一种胺基酸)的工厂。研究人员选择精胺酸是因为比起其他胺基酸,细胞製造精胺酸需要用到更多的氮。因为细菌必须不断取得氮来製造精胺酸,使得细菌成为吞噬氨的机器。Synlogic公司的执行长古提亚瑞兹-拉莫斯(Jose-Carlos Gutierrez-Ramos)提到,具有这种基因线路的细菌,能产生「比正常菌株多5,000倍的精胺酸」。

这种基因线路的开关是一段DNA序列,透过一种名为FNR的蛋白质启动开关。就像空调恆温器一样,FNR对于细菌周围环境的变化相当敏感,一旦大肠桿菌在缺氧环境中下,FNR便能产生反应。当FNR侦测到细菌处于低氧环境(例如大肠里),FNR会活化细菌繁殖所需的基因;当细菌移动到人体外富含大量氧气的环境,FNR就停止作用,这种安全机制能防止微生物失控快速生长。一旦微生物随着粪便离开肠道进入高氧环境,整个基因线路系统就会关闭,大肠桿菌便死亡。

然而,米勒提到其中一个问题︰大肠桿菌的基因组内具有argR的基因做为「抑制子开关」(repressor switch),当它侦测到细菌拥有足够精胺酸时,会关闭生产机制。因此,研发人员需要在线路中加入停用argR的机制,他们利用一段长度相等但不含有argR基因的DNA片段取代argR基因与其周围的DNA序列,藉此移除argR的作用。

还有几名合成生物学家开发出其他基因线路,可把抗癌药物送到肿瘤深处。哈斯提在一种对人类无害的沙门氏菌菌株中嵌入一套特殊的遗传指令,这项实验性抗癌疗法採用最新的研究发现,即有些细菌常常出现在肿瘤内部。科学家相信(但还不确定)原本在血液中循环的细菌会被吸引到肿瘤,哈斯提表示,这可能是「因为肿瘤提供了细菌躲避免疫系统侦察的安全避难所」。

哈斯提设计的抗癌疗法迫使沙门氏菌进行两道程序︰首先,基因线路会让细菌製造抗癌药物并储存于内部;随后细菌经由血液进入肿瘤内部(肿瘤从血液获得养份)。在某个时刻,基因线路会指示沙门氏菌自我摧毁,细菌破裂便释出治疗药物。哈斯提说:「这项任务就好像是自杀攻击。」

以电子线路概念改造有害细菌的DNA:医疗变形细菌 By Centers for Disease Control and Prevention - Centers for Disease Control and Prevention, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1329721
肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)生长于培养基上的菌落。

哈斯提还有另一种巧夺天工的设计,他添加了几个基因组件让细菌疗法可以重新启动。他说:「我们引进『数量感应』(quorum-sensing)系统至细菌体内,让肿瘤内的沙门氏菌可以侦测整个族群是否达到一定数量。」当细菌繁殖到足够高的密度时,数量感应感测器会触发沙门氏菌内部释出由内而外裂解细菌的蛋白质,并进一步释出抗癌药物。这种自杀行为会杀死大多数沙门氏菌,但会留下部份细菌。剩余的细菌则再次启动繁殖,一次次驱动这种循环。

由肿瘤内部启动攻击的概念特别具有吸引力,因为大多数化疗药物是从肿瘤外部开始运作。哈斯提提到,在小鼠研究中单独使用细菌治疗并没有比标準化疗效果更好,不过联合两种疗法时,「我们发现罹患转移癌的小鼠肿瘤缩小了,而且预期寿命增加了50%。」

新领域.新法规.新应用

研发人员仍持续改善沙门氏菌疗法,而Synlogic的UCD疗法还有很长的路要走,FDA的核准程序也正在进行,他们会仔细审查这种首次以基因修饰微生物为核心的疗法;FDA已颁布了新的管理类别「活体生物治疗产品」与法规,来规範微生物疗法。与其他药物不同(除了一些疫苗),新疗法由活体生物组成,因此可能在繁殖过程出现突变,FDA希望申请者能确认不同批次的治疗性微生物不会出现变异。此外,FDA也希望证实这些微生物如Synlogic所宣称,无法在人体外的环境中生存。哈斯提说:「我们也在观察FDA如何处理Synlogic的案例,如果细菌疗法无法获得FDA核准,合成生物疗法的发展可能会陷入僵局。」

用于检测疾病而不会在人体製造新化合物的基因修饰细菌检测法,可能会更快通过FDA的审核程序,它比起基因修饰细菌疗法的价位也更便宜。许多新兴的合成生物学计画的目标是重塑细菌以诊断早期疾病,哈佛大学系统生物学研究所的创办人之一席佛(Pamela Silver)说:「研究人员能把肠道细菌设计成可以侦测、记忆并输出它们进出肠道的过程。」席佛的实验室开创了一套由基因线路组成的检测工具,证实能让细菌识别小鼠消化系统里是否有抗生素;如果消化系统里出现活性抗生素,该基因线路会让小鼠粪便发出萤光信号。  

席佛说:「合成基因线路证实我们有能力打造活的检测系统,在这一案例中,可以检测抗生素的存在。」最终目标是使用这项技术来侦测肠道内潜在的疾病迹象,她说:「人类肠道是个难以探索的幽暗之处,但会影响日常健康和疾病状态,其中最为普遍的是发炎反应。」目前消化道疾病的检测方法是採用侵入式工具,而且价格昂贵。席佛认为微生物诊断提供更便宜且灵敏的工具,一旦通过FDA审查,也可添加新功能。她说:「我们相信可改造检测型基因线路,使其得以治疗肠道疾病的发炎部位。崭新的基因线路正展现创造各种可能性的巨大潜力。」

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